خالص سازی و تعیین خصوصیات یک آنزیم آلفا-آمیلاز و یک ÷روتئاز خارج سلولی حاصل از باکتری باسیلوس سوبتیلیس atcc1254

چکیده: آلفا-آمیلازها و پروتئازها دو آنزیم خارج سلولی هستند که به ترتیب پیوندهای 1-4، ?-d-گلیکوزیدی بین واحدهای گلوکز در زنجیره خطی آمیلوز و پیوندهای پپتیدی پروتئین ها را هیدرولیز می کنند. این آنزیم ها از مهمترین آنزیم های صنعتی به شمار رفته و در بیوتکنولوژی امروزی نقش مهمی ایفا می کنند. اگرچه آن ها از منابع گیاهی، جانوری و میکروبی بدست می آیند، اما در صنعت بیشترین تقاضا برای آنزیم های میکروبی وجود دارد. در میان باکتری ها، آنزیم های مربوط به جنس باسیلوس مهمترین منبع آلفا-آمیلاز و پروتئاز به حساب می آیند و معمولاً برای تولید آن ها مورد استفاده قرار می گیرند. تعداد زیادی از آلفا-آمیلازها و پروتئازها با تفاوت در وزن مولکولی، دما و ph بهینه برای فعالیت گزارش شده اند. آلفا-آمیلازها و پروتئازهایی که از خصوصیات مطلوبی مانند پایداری حرارتی، عدم وابستگی به یون های فلزی، فعالیت در طیف وسیعی از ph و غیره برخوردارند، می توانند در صنایع مربوطه مورد استفاده قرار گیرند. از اینرو جستجو برای یافتن میکروارگانیسم های جدید و جدا کردن و خالص کردن آلفا-آمیلازها و پروتئازهای جدید از آن ها در سراسر دنیا افزایش یافته است. در این مطالعه سویه ی bacillus subtilis atcc1254 به منظور یافتن باکتری جدید تولید کننده آلفا-آمیلاز و پروتئاز از مرکز کلکسیون قارچها و باکتری های ایران تهیه شد. بیشترین میزان تولید این آنزیم ها توسط این سویه در دمای 42 درجه سانتی گراد، 5/6=ph و بعد از 72 ساعت کشت در محیط تولید صورت می گیرد. برای تخلیص این آنزیم ها، ابتدا محیط کشت با استفاده از نمک سولفات آمونیوم 85% تیمار شد. رسوب حاصله پس از حل شدن در بافر مناسب و دیالیز کردن از ستون کروماتوگرافی تعویض آنیونی deae- سفارز و سپس ستون فیلتراسیون ژلی عبور داده شد. در طی فرآیند تخلیص، فعالیت ویژه آنزیم آلفا-آمیلاز از u/mg 5/312 در محیط کشت، بعد از دو مرحله کروماتوگرافی، به u/mg 466 افزایش یافت. با استفاده از sds-page وزن مولکولی آمیلاز و پروتئاز به ترتیب 66 و 29 کیلودالتون تخمین زده شد. این آنزیم ها در محدوده وسیعی از ph فعال هستند، آمیلاز در محدوده 7-4 بیشترین فعالیت را دارا می باشد و 70% فعالیت خود را در 3= phحفظ می کند و پروتئاز در محدوده ph 7-5 دارای بیشینه فعالیت می باشد. دمای بهینه برای فعالیت این آنزیم ها 50 درجه سانتی گراد است. فعالیت و پایداری این آنزیم در محدوده وسیع ph یک خصوصیت مهم بوده و نیاز به فرآیند هزینه بر و وقت گیر تعدیل ph در استفاده های آتی این آنزیم ها در صنعت را حذف می کند. از اینرو، آلفا-آمیلاز و پروتئاز حاصل از سویه bacillus subtilis atcc1254 با داشتن چنین خصوصیاتی می توانند در برخی صنایع به ویژه صنایع غذایی و پاک کننده ها کاربرد داشته باشند.